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光學(xué)顯微鏡觀察方式大盤點(diǎn)：霍夫曼調(diào)制相襯

霍夫曼調(diào)制相襯(Hoffman Modulation Contrast，簡(jiǎn)稱HMC)是ROBERT HOFFMAN教授于1975年提出的一種觀察方式①，是基于斜照明技術(shù)加入偏振鏡、狹縫光闌和調(diào)制器改進(jìn)而來(lái)的一種透明樣品觀察技術(shù)，特點(diǎn)是有三維立體感，且適用于塑料培養(yǎng)皿，有人稱之為“窮人的DIC”，主要用于IVF注射等顯微操作。

MF53-HMC拍攝的卵母細(xì)胞

一、成像原理

斜照明成像與明場(chǎng)成像對(duì)比②

斜照明（Oblique Illumination）技術(shù)又稱離軸照明（Off-Axis Illumination），是一種非常古老的顯微鏡技術(shù)，1866年由德國(guó)物理學(xué)家August Toepler提出③，并由阿貝聚光鏡的發(fā)明者Ernst Abbe完善，基本思路是利用偏軸光照射樣品，然后經(jīng)過(guò)透明樣品發(fā)生衍射、反射和折射，最終除了未衍射的0級(jí)光，還能把一兩個(gè)臨近級(jí)別的衍射光（1級(jí)和-1級(jí)）用到成像中，從而提升分辨率和焦深，形成浮雕樣式的立體成像，因此這種觀察方式又稱浮雕相襯（Relief Contrast，簡(jiǎn)稱RC）。

標(biāo)準(zhǔn)PH相襯和CK40的RPC斜照明相襯，注意斜照明下整個(gè)畫面明暗漸變

斜照明提升分辨率和焦深的原理

斜照明很多地方跟簡(jiǎn)易透射暗場(chǎng)相近，只是它的光闌不是環(huán)形的，而是半圓或其他狹縫形狀，有更強(qiáng)方向性。題外話一句，極紫外光刻EUV也使用了斜照明技術(shù)。

霍夫曼光路結(jié)構(gòu)

霍夫曼調(diào)制相襯在斜照明基礎(chǔ)上加入了三個(gè)部件，偏振鏡，狹縫聚光鏡和物鏡調(diào)制器，使部分衍射光的強(qiáng)度大于背景光，部分衍射光的強(qiáng)度小于背景光，這樣就形成更高對(duì)比度的立體成像。

當(dāng)前霍夫曼調(diào)制相襯的專利已經(jīng)過(guò)了保護(hù)期，四大品牌都推出了自己的HMC技術(shù)，奧林巴斯Evident叫浮雕相襯RC（Relief Contrast，繼承以前RPC的命名），尼康叫高級(jí)調(diào)制相襯NAMC（Nikon Advanced Modulation Contrast），蔡司叫改進(jìn)型調(diào)制相襯iHMC（Improved Hoffman Modulation Contrast），徠卡叫整合調(diào)制相襯IMC（Integrated Modulation Contrast），除了徠卡的是特有的機(jī)身調(diào)制器取代物鏡調(diào)制器，其他跟原始設(shè)計(jì)差距不大。

二、關(guān)鍵部件

典型霍夫曼相襯需要三個(gè)部件，偏振鏡，霍夫曼聚光鏡（帶狹縫光闌），霍夫曼物鏡（帶物鏡調(diào)制器）。

MF53-HMC的霍夫曼相襯配件

·光源偏振鏡

光源偏振鏡在光源和聚光鏡之間

偏振鏡在光源和聚光鏡之間，相當(dāng)于一個(gè)起偏器，它可以旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)后可以調(diào)整成像的立體感和對(duì)比度。

·霍夫曼聚光鏡

霍夫曼聚光鏡，注意半透明的狹縫檢偏器

霍夫曼聚光鏡又稱狹縫聚光鏡，一般采用轉(zhuǎn)盤式設(shè)計(jì)，按照10X/20X/40X三個(gè)倍數(shù)有不同的狹縫光闌裝在聚光鏡前焦面，另有留空孔用于明場(chǎng)觀察。

聚光鏡狹縫光闌分為三個(gè)部分：占大部分的暗區(qū)，不透光；離軸的狹縫，100%透光；狹縫檢偏器，連著狹縫，尺寸跟狹縫相近，旋轉(zhuǎn)光源偏振鏡會(huì)改變這個(gè)區(qū)域的通光率，可以改變成像立體感和對(duì)比度。

注意：由于樣品在起偏檢偏的光路之后，而不是在起偏檢偏之間，因此霍夫曼可以看塑料培養(yǎng)皿和塑料樣品。

簡(jiǎn)化版的霍夫曼沒(méi)有偏振鏡，狹縫光闌只有暗區(qū)和狹縫，沒(méi)有狹縫檢偏器。

·霍夫曼物鏡

霍夫曼物鏡會(huì)有HMC、PMC、NAMC等標(biāo)記

霍夫曼物鏡跟相襯物鏡相似，在物鏡后端的后焦平面上嵌入了精密的物鏡調(diào)制器，這個(gè)調(diào)制器不能移動(dòng)不能取出。

霍夫曼物鏡后端可見(jiàn)三個(gè)區(qū)域

物鏡調(diào)制器分成三個(gè)區(qū)域：在邊緣的暗區(qū)，透射1%光線；狹窄的灰區(qū)，透射10-15%光線；透明區(qū)，連著灰區(qū)，100%透光。

霍夫曼物鏡能用于明場(chǎng)、暗場(chǎng)和熒光觀察，但用在熒光觀察時(shí)效果不佳，因?yàn)橛姓{(diào)制器，其透光率低于普通明場(chǎng)物鏡。

注意：霍夫曼的狹縫光闌和物鏡調(diào)制器有很強(qiáng)的方向匹配關(guān)系，物鏡擰緊后，需要調(diào)整聚光鏡狹縫方向來(lái)匹配，非專業(yè)人士請(qǐng)不要調(diào)霍夫曼物鏡或聚光鏡，否則很難調(diào)節(jié)回最佳狀態(tài)。

IMC可調(diào)的狹縫插板，統(tǒng)一的物鏡調(diào)制器（IMC/BF文字和孔位相對(duì)而非相鄰）

另外整合調(diào)制相襯IMC的物鏡調(diào)制器設(shè)置在了物鏡后焦面的共軛面上，也就是在機(jī)身內(nèi)置而非物鏡內(nèi)置，因此可以使用霍夫曼物鏡以外的物鏡。但必須提醒的是，IMC是組合消色差設(shè)計(jì)，物鏡與觀察頭是成套搭配實(shí)現(xiàn)消色差的，隨便換物鏡可能破壞消色差設(shè)計(jì)導(dǎo)致效果不佳。

三、成像特點(diǎn)

霍夫曼調(diào)制相襯成像接近DIC微分干涉，并且在使用層面上還有成本更低、工作空間大、可以觀察塑料培養(yǎng)皿等優(yōu)勢(shì)，因此廣泛應(yīng)用于顯微操作、IVF輔助生殖等領(lǐng)域。

霍夫曼可觀察塑料等各向同性材料，DIC不能④

1、強(qiáng)立體感

霍夫曼可以提高透明樣品的可見(jiàn)性和對(duì)比度，圖像有強(qiáng)立體感，效果接近DIC，有利于顯微操作。

霍夫曼拍攝的口腔上皮細(xì)胞

2、豐富細(xì)節(jié)，無(wú)光暈

霍夫曼沒(méi)有澤尼克相襯的光暈瑕疵，成像邊緣更清晰，且焦深更大，細(xì)節(jié)豐富。

樣品形狀和方向不同影響了霍夫曼成像畫質(zhì)

3、強(qiáng)方向性，低可重復(fù)性

這是個(gè)缺點(diǎn)，霍夫曼觀察的效果與狹縫方向、樣品方向相關(guān)。舉例而言，兩臺(tái)霍夫曼顯微鏡，物鏡擰緊之后的旋轉(zhuǎn)角度可能不一致，對(duì)應(yīng)聚光鏡狹縫的角度也會(huì)不一致，即便樣品在兩臺(tái)顯微鏡之間平移，得出的成像也會(huì)有不同，相同原理，同一臺(tái)霍夫曼顯微鏡，樣品旋轉(zhuǎn)角度不同，即便相同區(qū)域成像也會(huì)不同。這導(dǎo)致霍夫曼等所有基于斜照明的系統(tǒng)都存在可重復(fù)性問(wèn)題，因此論文普遍傾向用更高可重復(fù)性的相襯和DIC等觀察方式。

四、主要應(yīng)用

霍夫曼顯微注射

1、IVF輔助生育

霍夫曼的強(qiáng)立體感和大工作空間，讓它非常適合精密的顯微操作使用，比如在IVF輔助生育領(lǐng)域，霍夫曼可以為卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)提供成像支持。

2、轉(zhuǎn)基因研究

類似IVF中的精子注射，在各種轉(zhuǎn)基因研究中也有類似的原核注射（pronucleus injection）技術(shù)，使用霍夫曼可以為顯微操作提供精確的立體成像支持。

五、明美產(chǎn)品推薦

1、顯微操作成像平臺(tái)：MF53-HMC/MIX60-HMC

• 成像具有類似DIC的強(qiáng)立體感，適合卵母等透明樣品

• 成本比DIC更有優(yōu)勢(shì)，適合IVF等規(guī)模化使用

• 帶偏光鏡，可調(diào)節(jié)成像立體感和對(duì)比度

• 可以滿足較厚透明樣品觀察

①HOFFMAN, R., GROSS, L. The modulation contrast microscope. Nature 254, 586–588 (1975). https://doi.org/10.1038/254586a0

②Pelc, Radek & Hostounsky, Zdeněk & Otaki, Tatsuro & Katoh, Kaoru. (2020). Conventional, Apodized, and Relief Phase-Contrast Microscopy. 10.1007/978-1-0716-0428-1_10. 

③To¨pler A (1866) Ueber die Methode derSchlierenbeobachtung als mikroskopischesHu¨lfsmittel, nebst Bemerkungen zur Theorieder schiefen Beleuchtung. (Poggendorff ’s)Annalen der Physik und Chemie (Leipzig)127(4):556–580. https://doi.org/10.1002/andp.18662030405 [Annalen der Physik (Ber-lin) 203(4):556–580]

④Hoffman, R. (1989). Modulation Contrast and Differential Interference Contrast Techniques. In: Hemsley, D.A. (eds) Applied Polymer Light Microscopy. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94-011-7474-9_5

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